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人紅細(xì)胞反定型試劑注冊技術(shù)審查指導(dǎo)原則（2016年第131號）

本指導(dǎo)原則旨在指導(dǎo)注冊申請人對人紅細(xì)胞反定型試劑注冊申報資料的準(zhǔn)備及撰寫，同時也為技術(shù)審評部門審評注冊申報資料提供參考。

本指導(dǎo)原則是對人紅細(xì)胞反定型試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品的具體特性確定其中內(nèi)容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)，并依據(jù)產(chǎn)品的具體特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充實和細(xì)化。

本指導(dǎo)原則是供申請人和審查人員使用的指導(dǎo)文件，不涉及注冊審批等行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如有能夠滿足法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但應(yīng)提供詳細(xì)的研究資料和驗證資料。應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。

本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)體系及當(dāng)前認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)體系的不斷完善和科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將適時進行調(diào)整。

一、范圍

人紅細(xì)胞反定型試劑用于人ABO血型的反定型，測定被檢者血清中有無相應(yīng)的抗A或抗B抗體，輔助正定型結(jié)果判斷ABO血型。

本指導(dǎo)原則適用于人紅細(xì)胞反定型試劑，同時適用于不同的檢測方法,如試管法、柱凝集法、微孔板法等，但不適用于血源篩查用人紅細(xì)胞反定型試劑。

本指導(dǎo)原則僅包括對人反定型紅細(xì)胞試劑注冊申報資料中部分項目的要求，適用于進行產(chǎn)品注冊和相關(guān)許可事項變更的產(chǎn)品。其他未盡事宜，應(yīng)當(dāng)符合《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號）（以下簡稱《辦法》）等相關(guān)法規(guī)要求。

二、基本要求

（一）綜述資料

綜述資料的撰寫應(yīng)符合《關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告2014年第44號）（以下簡稱“44號公告”）的相關(guān)要求。內(nèi)容主要包括產(chǎn)品預(yù)期用途、產(chǎn)品描述、有關(guān)生物安全性的說明、有關(guān)產(chǎn)品主要研究結(jié)果的總結(jié)和評價以及同類產(chǎn)品在國內(nèi)外批準(zhǔn)上市的情況介紹等內(nèi)容，其中同類產(chǎn)品上市情況介紹部分應(yīng)著重從抗原性、特異性、親和力、溶血率、有效期等方面寫明擬申報產(chǎn)品與目前市場上已獲批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品之間的異同。

（二）主要原材料研究資料

主要原材料研究資料應(yīng)包括主要組成成分（紅細(xì)胞及細(xì)胞保存液成分等）的選擇、制備及其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究資料。

1.紅細(xì)胞的選擇及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。需詳細(xì)描述紅細(xì)胞的來源。紅細(xì)胞來源應(yīng)穩(wěn)定、可靠，采集時間期限明確。紅細(xì)胞的選擇應(yīng)遵循以下原則：

（1）如紅細(xì)胞Rh表型為陽性(D+、C+、E+)，則應(yīng)在A1、B紅細(xì)胞外增加Rh陽性的O型紅細(xì)胞。

（2）如只包含A1、B紅細(xì)胞，則兩支紅細(xì)胞均應(yīng)為Rh表型陰性（D-、E-、C- ）的混合細(xì)胞懸液。

應(yīng)對試劑紅細(xì)胞進行以下基本特性的研究：

紅細(xì)胞獻血員應(yīng)進行血型正反定型檢測，只有在正反定型結(jié)果一致的情況下，其紅細(xì)胞才能用于生產(chǎn)。

①紅細(xì)胞的抗原性：反定型紅細(xì)胞至少要包括A1和B細(xì)胞，使用A2和O細(xì)胞測定可解決部分血型測定中的異常情況，A2細(xì)胞可測定A亞型，O細(xì)胞可在測定中作為抗原陰性對照。

②紅細(xì)胞的抗原強度：通過考察不同凝集強度時抗體試劑（抗-A、抗-B、抗-H）的稀釋度，說明試劑紅細(xì)胞的抗原強度。

③親和力：通過與相應(yīng)抗體（抗-A、抗-B、抗-H）反應(yīng)在多少秒（如15秒）內(nèi)出現(xiàn)凝集，3分鐘內(nèi)凝集塊達(dá)到1mm2以上（或凝集強度≥3+）等指標(biāo)體現(xiàn)細(xì)胞親和力，可參照相關(guān)規(guī)定進行試驗及結(jié)果判斷?？贵w效價應(yīng)符合國家規(guī)定。

④紅細(xì)胞的特異性：使用抗-A、抗-A1抗-B、抗-H抗體進行特異性驗證。不與ABO血型系統(tǒng)非對應(yīng)抗體發(fā)生陽性反應(yīng)。

⑤直接抗人球蛋白試驗：使用抗-IgG和抗-補體或使用多特異性抗人球蛋白試劑對試劑紅細(xì)胞進行直接抗人球蛋白試驗（DAT）時，結(jié)果應(yīng)為陰性。

⑥溶血率（性）：明確溶血率的試驗方法、實驗所需物品及溶血率的要求。可采用溶血率或游離血紅蛋白濃度的作為評價指標(biāo)。

⑦紅細(xì)胞濃度的確定：說明紅細(xì)胞懸浮液的濃度和限度（如3%±0.2%）。

2.紅細(xì)胞保存液的選擇：說明紅細(xì)胞保存液的選擇過程，提交試驗數(shù)據(jù)說明最終確定的保存液在保證細(xì)胞的抗原性（抗原減弱）、減少溶血等方面的性能。需明確保存液中各組分的基本作用，如何防止溶血、抗原減弱、補體激活等。另外應(yīng)對紅細(xì)胞保存液的以下性能進行研究：

（1）PH值。

（2）在選定的保存液環(huán)境中進行試劑紅細(xì)胞穩(wěn)定性的研究，進行詳細(xì)的效期穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性的研究。

3.生物安全性。

（三）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究資料

1.主要生產(chǎn)工藝介紹，可用流程圖方式表示，并簡要說明主要生產(chǎn)工藝的確定依據(jù)。

2.產(chǎn)品基本反應(yīng)原理介紹。

3.主要生產(chǎn)工藝過程的研究資料、每一步生產(chǎn)工藝的確認(rèn)資料及試驗數(shù)據(jù)。

4.主要反應(yīng)體系（不同的實驗原理、實驗方法）的研究資料、每一步反應(yīng)體系的確認(rèn)資料及試驗數(shù)據(jù)。

反應(yīng)體系的設(shè)置應(yīng)符合《全國臨床檢驗操作規(guī)程》等公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范、指南或標(biāo)準(zhǔn)的要求。

（四）分析性能評估資料

申請人應(yīng)提交生產(chǎn)者在產(chǎn)品研制或成品驗證階段對試劑進行的所有性能驗證的研究資料，對于每項分析性能的評價都應(yīng)包括具體研究目的、實驗設(shè)計、研究方法、可接受標(biāo)準(zhǔn)、實驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計方法等詳細(xì)資料。有關(guān)分析性能驗證的背景信息也應(yīng)在申報資料中有所體現(xiàn)，包括實驗地點（實驗室）、適用儀器、試劑規(guī)格、批號、臨床樣本來源等。分析性能評估的實驗方法可以參考國內(nèi)或國際有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評估的指導(dǎo)原則進行。

產(chǎn)品性能研究所采用的各種儀器、試劑或其他物品如可能均應(yīng)采用境內(nèi)或境外已批準(zhǔn)上市的產(chǎn)品，如抗A、抗B 、抗H、抗人球蛋白試劑等。

分析性能評估試驗中應(yīng)明確所有試驗每種試劑的用量、試劑紅細(xì)胞的濃度、采用的試驗方法（試管法、柱凝集法、微孔板法等）。所有試驗方法應(yīng)符合配合使用的血型試劑的具體操作要求。

應(yīng)對申報的反定型紅細(xì)胞試劑聲稱適用的所有試驗方法進行分析性能評估，如試管法、柱凝集法、微孔板法等。不同試驗方法的性能研究均應(yīng)采用至少三批產(chǎn)品進行。對于人紅細(xì)胞反定型試劑，建議著重對以下分析性能進行研究：

1.紅細(xì)胞的抗原性：以表1的反應(yīng)格局說明紅細(xì)胞的抗原性。

2.紅細(xì)胞的抗原強度：紅細(xì)胞的抗原強度應(yīng)不低于表2要求。

3.親和力

抗-A、抗-B、抗-H與試劑紅細(xì)胞A1、A2、B、O混合后，應(yīng)在多少秒內(nèi)（如15秒內(nèi)）出現(xiàn)肉眼可見的凝集，3分鐘內(nèi)凝集塊達(dá)到1mm2以上（或凝集強度≥3+）。

4.紅細(xì)胞的特異性：以表3的反應(yīng)格局說明紅細(xì)胞的特異性。

5.直接抗人球蛋白試驗

使用抗-IgG和抗-補體或多特異性抗人球蛋白試劑進行試劑紅細(xì)胞直接抗人球蛋白試驗時，結(jié)果應(yīng)為陰性。

6.溶血率（性）

明確每種試劑紅細(xì)胞溶血率的試驗方法、使用物品、測量方法、結(jié)果計算方法等內(nèi)容。

可采用百分比進行結(jié)果報告，也可采用濃度單位報告結(jié)果。

7.樣本抗凝劑的選擇。

8.溶血、脂血、黃疸等樣本的干擾評價。

9.無菌試驗。

（五）陽性判斷值

給出不同凝集強度的研究方法，并明確不同凝集強度代表的具體意義，并應(yīng)包含溶血、混合視野雙群等情況，明確具體的試驗方法、實驗步驟，提供不同凝集強度的圖例或相片。

（六）穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內(nèi)容，申報紅細(xì)胞試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。前者主要包括實時穩(wěn)定性（有效期）、運輸穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性等研究，申請人可根據(jù)實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案，實驗項目應(yīng)至少包括紅細(xì)胞抗原性、凝集強度、特異性、溶血率、無菌試驗。

穩(wěn)定性研究資料應(yīng)包括研究方法的確定依據(jù)、具體的實施方案、詳細(xì)的研究數(shù)據(jù)以及結(jié)論。對于實時穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

應(yīng)對樣本穩(wěn)定性進行研究，主要包括室溫保存、冷藏和冷凍條件下的有效期驗證，可以在合理的溫度范圍內(nèi)選擇溫度點（溫度范圍），每間隔一定的時間段對儲存樣本進行全性能的分析驗證，從而確認(rèn)不同類型樣本的穩(wěn)定性。適于冷凍保存的樣本還應(yīng)對凍融次數(shù)進行評價。

試劑穩(wěn)定性和樣本穩(wěn)定性兩部分內(nèi)容的研究結(jié)果應(yīng)分別在說明書【儲存條件及有效期】和【樣本要求】兩項中進行詳細(xì)說明。

（七）臨床試驗

臨床試驗總體要求及臨床試驗資料的內(nèi)容應(yīng)符合《體外診斷試劑臨床試驗指導(dǎo)原則》《辦法》、“44號公告”的規(guī)定，以下僅結(jié)合人紅細(xì)胞反定型試劑的具體特點對其臨床試驗中應(yīng)重點關(guān)注的內(nèi)容進行闡述。

1.研究方法

該類試劑已有同類產(chǎn)品上市，按照法規(guī)要求應(yīng)選擇境內(nèi)已批準(zhǔn)上市、臨床普遍認(rèn)為質(zhì)量較好的同類產(chǎn)品作為對比試劑，采用試驗用體外診斷試劑（以下稱考核試劑）與之進行比較研究試驗，證明本品與已上市產(chǎn)品等效。

2.臨床試驗單位的選擇

應(yīng)選擇符合法規(guī)要求的臨床試驗機構(gòu)進行臨床試驗，不得選擇血站或采供血機構(gòu)進行臨床試驗。

3.病例選擇

臨床總病例數(shù)應(yīng)不少于3000例。應(yīng)采用臨床患者進行臨床研究，應(yīng)包括對反定型檢測易產(chǎn)生干擾的病例，如選擇各種疾病患者（腫瘤患者、自身免疫病患者、血液病患者等）、老人、兒童（不同年齡段）、正反定型不一致的病例等。

4.試驗過程

在進行反定型紅細(xì)胞試劑臨床試驗的過程中除與對比試劑進行比較外，應(yīng)同時給出該樣本的正定型試驗結(jié)果，以進一步判斷反定型結(jié)果的準(zhǔn)確性。

產(chǎn)品如適用于不同的試驗方法（如試管法、柱凝集法、微孔板法等），每種試驗方法均應(yīng)分別進行至少3000例的臨床試驗，并明確配合使用的試劑產(chǎn)品，配合使用的產(chǎn)品均應(yīng)是境內(nèi)已上市產(chǎn)品。

5.統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)分別進行正反定型結(jié)果、考核試劑與對比試劑的陽性符合率、陰性符合率、總符合率的計算，并以四格表的形式進行列表，并對定性結(jié)果進行Kappa檢驗以驗證檢測結(jié)果的一致性。

6.結(jié)果差異樣本的驗證

對于兩種試劑檢測結(jié)果不一致（包括正反定型結(jié)果不一致、考核試劑與對比試劑結(jié)果不一致、與對比試劑凝集強度差異較大）的樣本，應(yīng)采用臨床上公認(rèn)較好的第三種同類試劑進行確認(rèn)試驗，同時應(yīng)結(jié)合樣本的正定型結(jié)果進行綜合分析，最終應(yīng)采用適合的方法進行樣本血型的最終確認(rèn)。

7.臨床試驗數(shù)據(jù)記錄表應(yīng)作為臨床試驗報告附件提交。臨床試驗數(shù)據(jù)記錄表應(yīng)列明所有病例的具體臨床診斷信息、凝集強度和血型正反定型結(jié)果，如有不符樣本應(yīng)列明第三方確認(rèn)的結(jié)果。

（八）產(chǎn)品風(fēng)險分析資料

產(chǎn)品風(fēng)險分析資料應(yīng)符合“44號公告”的基本要求，并參照相應(yīng)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進行風(fēng)險分析。風(fēng)險分析中應(yīng)充分考慮到各種可能影響檢測結(jié)果的因素，如某些樣本（如腫瘤患者、自身免疫病患者、血液病患者等）在進行血型反定型檢測時可能存在一定的干擾、影響試劑紅細(xì)胞穩(wěn)定性的諸多因素可能導(dǎo)致的細(xì)胞抗原性減弱、新生兒或老年人可能因為抗體較弱影響檢測結(jié)果等，申請人應(yīng)根據(jù)這些不確定的因素分析產(chǎn)品應(yīng)用可能存在的風(fēng)險。

（九）產(chǎn)品技術(shù)要求

申請人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)產(chǎn)品研制、性能評估等結(jié)果，依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)文獻，按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》的有關(guān)要求，編寫產(chǎn)品技術(shù)要求。產(chǎn)品技術(shù)要求應(yīng)符合《辦法》和“44號公告”的相關(guān)規(guī)定。

如果擬申報試劑已有相應(yīng)的國家/行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布，則企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的要求不得低于上述標(biāo)準(zhǔn)要求。

產(chǎn)品技術(shù)要求的性能指標(biāo)應(yīng)至少包括紅細(xì)胞的抗原性、紅細(xì)胞的抗原強度、紅細(xì)胞的特異性、直接抗人球蛋白試驗、溶血率（性）、親和力。

（十）產(chǎn)品注冊檢驗報告

根據(jù)《辦法》要求，申請注冊的第三類體外診斷試劑應(yīng)在國家食品藥品監(jiān)督管理總局認(rèn)可的、具有相應(yīng)承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗機構(gòu)進行連續(xù)三個生產(chǎn)批次樣品的注冊檢驗。

（十一）產(chǎn)品說明書

說明書承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、試驗原理、試驗方法、檢測結(jié)果解釋以及注意事項等重要信息，是指導(dǎo)實驗室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對檢驗結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解釋的重要依據(jù)，因此，產(chǎn)品說明書是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。產(chǎn)品說明書的格式應(yīng)符合《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》的要求，境外產(chǎn)品的中文說明書除格式要求外，其內(nèi)容應(yīng)盡量保持與原文說明書的一致性，翻譯力求準(zhǔn)確且符合中文表達(dá)習(xí)慣。產(chǎn)品說明書的所有內(nèi)容均應(yīng)與申請人提交的注冊申報資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻，則應(yīng)以規(guī)范格式對此內(nèi)容進行標(biāo)注，并單獨列明參考文獻的相關(guān)信息。

以下內(nèi)容僅對人紅細(xì)胞反定型試劑說明書的重點內(nèi)容進行詳細(xì)說明，說明書其他內(nèi)容應(yīng)根據(jù)《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》要求進行編寫。

1.【預(yù)期用途】

（1）寫明本試劑用于人血型的反定型檢測，同時明確不用于血源篩查，僅用于臨床檢驗。

（2）明確產(chǎn)品的檢測結(jié)果必須結(jié)合正定型的檢測結(jié)果才能進行ABO血型的準(zhǔn)確定型。

（3）說明與預(yù)期用途相關(guān)的臨床適應(yīng)癥背景情況，說明相關(guān)的臨床或?qū)嶒炇以\斷方法。

2.【儲存條件及有效期】

說明試劑的儲存條件及有效期、開瓶穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性等。

3.【樣本要求】

明確溶血、脂血、黃疸樣本是否可以使用，或提供使用此類樣本的最低要求。依據(jù)穩(wěn)定性研究結(jié)果寫明樣本穩(wěn)定性。

明確適用的抗凝劑的要求。

明確具體的樣本采集、處理方法及過程。

4.【陽性判斷值】

明確各種試驗方法的結(jié)果判斷方法及標(biāo)準(zhǔn)，并通過不同凝集強度的圖例或照片進行詳細(xì)解釋。

5.【檢驗方法】

如適用于不同的試驗方法請分別寫明具體方法及操作步驟。如配合其他試劑進行試驗，需注明試驗方法應(yīng)完全符合配合試劑的試驗操作要求。

質(zhì)控要求：為確保試劑測定的準(zhǔn)確性，每天要使用已知弱反應(yīng)性抗血清測定試劑細(xì)胞的反應(yīng)性。每次測定時用自身細(xì)胞進行同步對照是有意義的。應(yīng)根據(jù)相關(guān)規(guī)定進行每日質(zhì)控試驗。

6.【檢驗方法的局限性】

（1）老年人及兒童ABO 抗體弱，某些疾病患者如腫瘤、多發(fā)性骨髓瘤、消化道疾病等反定型會出現(xiàn)弱反應(yīng)，甚至陰性反應(yīng)，結(jié)果應(yīng)慎重解釋。

（2）必須與正定型血型檢測同時進行，正反定型結(jié)果一致才能確定ABO血型。正反定型不一致時需要進一步檢測，單獨的反定型結(jié)果不能作為判斷ABO血型的依據(jù)。

（3）絕大多數(shù)A、B和O型血的ABO抗體凝集強度均較強，如凝集強度為2+以下，應(yīng)對弱陽性反應(yīng)進行確認(rèn)，以排除干擾或亞型，確保正確的ABO定型。