附件：微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）檢測試劑臨床試驗注冊審查指導原則（2022年第40號）.doc

微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）檢測試劑臨床評價
注冊審查指導原則

本指導原則旨在指導注冊申請人對微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）檢測試劑臨床評價資料的準備及撰寫，同時也為技術審評部門提供參考。

本指導原則是對微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）檢測試劑臨床評價的一般要求，申請人應依據產品的具體特性確定其中內容是否適用，若不適用，需具體闡述理由及相應的科學依據，并依據產品的具體特性對注冊申報資料的內容進行充實和細化。

本指導原則是供注冊申請人和技術審查人員的指導性文件，但不包括審評審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，應在遵循相關法規(guī)的前提下使用本指導原則。如果有能夠滿足相關法規(guī)要求的其他方法，也可以采用，但需要提供詳細的研究資料和驗證資料。

本指導原則是在現行法規(guī)和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規(guī)和標準的不斷完善，以及科學技術的不斷發(fā)展，相關內容也將適時進行調整。

一、適用范圍

本指導原則適用于采用熒光PCR-毛細管電泳法檢測結直腸癌患者腫瘤組織細胞基因組DNA中的MSI狀態(tài)，從而輔助鑒別結直腸癌中可能的林奇綜合征患者的體外診斷試劑。

對于采用其他檢測技術進行MSI檢測的產品，申請人可以根據產品特性考慮本指導原則的適用性，對不適用部分采用其他適當的評價方法，但需闡述不適用的理由，并驗證替代方法的科學合理性。特別是采用NGS方法檢測MSI時，在檢測位點、判讀方法等方面均與毛細管電泳法有顯著差異，應從檢驗原理的特點出發(fā)，設計科學的評價方法對產品臨床性能進行綜合評價。如申請其他預期用途，例如免疫治療藥物的伴隨診斷，申請人應針對該預期用途提供充分的臨床性能評價資料。

本指導原則適用于進行體外診斷試劑產品注冊申請和變更注冊申請的產品，重點針對臨床評價資料的準備及撰寫明確要求。

有關此類產品的背景信息以及本指導原則適用范圍確定的依據參見附件。

二、注冊審查要點

（一）臨床評價資料

1.臨床評價路徑和基本要求

該類試劑應通過臨床試驗路徑進行臨床評價，臨床試驗的開展應符合《體外診斷試劑注冊與備案管理辦法》《醫(yī)療器械臨床試驗質量管理規(guī)范》以及《體外診斷試劑臨床試驗技術指導原則》的相關要求，如相關法規(guī)、規(guī)章、規(guī)范性文件有更新，臨床試驗應符合更新后的要求。

2.臨床試驗開展應具備的基礎

臨床試驗開展應建立在充分的臨床前研究基礎之上，包括科學的產品設計、充分的分析性能研究、陽性判斷值研究等。

采用熒光PCR-毛細管電泳法進行MSI DNA檢測，一般對腫瘤組織與正常對照樣本分別進行相應微衛(wèi)星位點檢測，將兩者檢測峰圖進行比較，確定腫瘤組織中是否發(fā)生了微衛(wèi)星序列長度的變化（按照一定的陽性判斷值判定），同時通過設定適當的判定標準（發(fā)生序列長度變化的微衛(wèi)星位點數量）確定腫瘤組織的MSI 狀態(tài)（MSI-H、MSI-L/MSS）。MSI檢測的靈敏度和特異度與位點選擇、反應體系的確定、微衛(wèi)星序列長度變化判定標準以及MSI-H判定標準等產品設計因素直接相關，產品設計開發(fā)中應進行充分的驗證。同時，為了保證檢測準確性和可重復性，應針對樣本質量提出明確要求，例如組織樣本中腫瘤細胞比例，核酸提取純度和濃度等。

2.1微衛(wèi)星位點選擇

MSI檢測試劑在產品設計中最關鍵的問題之一在于微衛(wèi)星位點的選擇。

1997年Bethesda指南中推薦的是一個簡稱為“2B3D”的微衛(wèi)星位點組合（NCI panel），由 2個單核苷酸位點（BAT-25和BAT-26）和3個雙核苷酸位點（D2S123、D5S346和D17S250）組成。同時，該指南中也推薦了針對這一組合的判定標準：即5個微衛(wèi)星位點中2個或2個以上發(fā)生序列長度變化時，判定為MSI-H，1個發(fā)生序列長度變化時，判定為MSI-L，若5個微衛(wèi)星位點均沒有發(fā)生序列長度變化，則為微衛(wèi)星穩(wěn)定MSS。

2002年，NCI舉辦的第二次HNPCC研討會上對MSI的檢測進行了修訂和補充，推薦了由5個單核苷酸微衛(wèi)星位點構成的組合（Pentaplex Panel），經過后續(xù)修訂，形成了包括BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24、NR-27在內的5個單核苷酸微衛(wèi)星位點組合。

目前臨床上還有BAT-25、BAT-26、NR-21、NR-24和MONO-27五個單核苷酸位點組合。

綜上，多項研究對MSI檢測提出了不同的微衛(wèi)星位點組合，以單核苷酸微衛(wèi)星位點為主，一般包括5個位點，各個組合之間略有交叉和互補。

在MSI檢測試劑的設計過程中，申請人可依據相關文獻資料，結合自身的前期研究數據，綜合考慮備選位點在MSI-H患者中的陽性率、微衛(wèi)星序列長度變化易讀性等因素，選擇適當的位點組合，并設定合理的判定標準，從而對MSI-H實現靈敏和特異的檢測。申請人應特別關注針對中國人群的研究數據，位點組合應適合中國人群特點，滿足中國人群的臨床診斷需要。

最終臨床試驗數據應能夠證明該組合對于結直腸癌中LS患者輔助篩選具有較高的臨床靈敏度和良好的臨床特異度。申報資料中，申請人應詳述位點組合的選擇依據，提供相關文獻和數據。

2.2結果判讀

每個微衛(wèi)星位點毛細管電泳峰圖的解讀、微衛(wèi)星序列長度變化的判定標準以及MSI-H和MSI-L/MSS的判定標準是直接影響到產品臨床性能的關鍵要素，申請人應根據充分的臨床前研究數據，同時參考科研論文和文獻進行科學的設定，并在說明書中詳細說明。特別是對于一些可能出現的不易判讀的峰形，可在說明書中結合具體的圖示和舉例進行相應的說明。臨床試驗過程中嚴格按照說明書的要求進行操作和判讀。

3.臨床試驗設計和實施的要求

臨床試驗應選擇不少于3家（含3家）符合要求的臨床試驗機構開展。臨床試驗入組人群應為結直腸癌患者，樣本量應滿足統(tǒng)計學要求。

臨床試驗應按照說明書要求采集樣本、評價樣本質量、完成樣本處理、檢測和結果解讀。試驗中按要求進行相應的設盲操作，試驗全過程注意避免引入偏倚。臨床試驗產生的所有信息應進行詳實的記錄。

臨床性能評價應至少包括以下三方面研究：

3.1腫瘤組織細胞基因組MSI狀態(tài)（MSI-H、MSI-L/MSS）判定的性能研究

3.1.1如果申報產品采用的微衛(wèi)星位點組合已經得到臨床廣泛認可，則可以選擇如下任一種方法進行此部分臨床性能研究。

方法一：采用試驗體外診斷試劑與MMR蛋白IHC檢測進行比較研究，評價兩種檢測結果的一致性。

作為對比方法的MMR蛋白IHC檢測應采用已獲準上市、經臨床實踐認為性能良好的檢測試劑盒，并在臨床試驗質量管理下完成檢測。IHC檢測的MMR蛋白主要包括MLH1、MSH2、MSH6和PMS2，四種蛋白均為陽性表達，則為pMMR，任一MMR蛋白缺失即為dMMR。檢測過程中，樣本處理和結果解讀應符合相關操作規(guī)范和判讀標準的要求，試驗全過程做好質量控制。檢測結果應由有經驗的病理醫(yī)生進行判讀，并經雙人復核。為避免機構之間差異，試驗開始前應統(tǒng)一操作和判讀標準，并進行適當的機構間一致性評價。臨床試驗報告中應總結IHC檢測過程中的質控數據和結果。臨床試驗數據表中列出所有病理醫(yī)生的判讀結果和最終的結果解釋。

入組病例中dMMR和pMMR病例例數應分別滿足統(tǒng)計學要求，試驗設計時可采用目標值法公式對最低樣本量進行估算。

比較研究的試驗結果采用四格表方式進行總結，計算陽性/陰性符合率和總符合率及其95%置信區(qū)間。對于兩種方法檢測結果不一致的樣本，可結合患者LS相關基因胚系突變檢測及其他臨床診斷信息進行復核，也可以采用其他適當的方法對差異原因進行分析。

評價指標：與MMR蛋白IHC檢測的陽性符合率、陰性符合率95%置信區(qū)間下限一般分別不低于90%和95%。

方法二：采用試驗體外診斷試劑與已上市同類產品進行對比試驗，評價兩種試劑判定MSI-H和MSI-L/MSS的一致性。其中MSI-H和MSI-L/MSS樣本例數應分別滿足統(tǒng)計學要求，試驗設計時可采用目標值法公式對最低樣本量進行估算。兩種試劑判定MSI-H和MSI-L/MSS的陽性符合率、陰性符合率95%置信區(qū)間下限一般不低于95%。

3.1.2如果申報產品采用全新的微衛(wèi)星位點組合（包括全新的MSI-H判定標準），該組合在以往國內、外權威指南、規(guī)范等文件中均未有推薦，且尚未受到行業(yè)廣泛認可，則應首選上述方法一進行臨床性能評價，如有必要，申請人可同時結合方法二對產品臨床性能進行更加全面的評價，證明申報產品對于MSI-H和MSI-L/MSS判定的性能能夠滿足臨床需求。

3.2每個微衛(wèi)星位點檢測性能研究

采用試驗體外診斷試劑與Sanger測序法或檢測相同微衛(wèi)星位點的已上市同類產品進行對比試驗，評價試驗體外診斷試劑與對比方法檢測每個微衛(wèi)星位點的一致性。

臨床試驗前可采用適當的方法對每種微衛(wèi)星位點預期陽性（即有序列長度變化）例數和陰性（即無序列長度變化）例數進行最低樣本量估算，保證樣本量滿足統(tǒng)計學要求。

針對每個微衛(wèi)星位點的檢測結果分別采用四格表方式進行總結，計算陽性/陰性符合率和總符合率及其95%置信區(qū)間。對于兩種方法檢測結果不一致的樣本，可采用合理的方法進行復核，并逐一列出試驗體外診斷試劑、對比方法以及復核方法的檢測結果，如毛細管電泳圖、Sanger測序序列圖等，對差異原因進行詳細分析。對于Sanger測序法，受到方法學限制，可能不能準確讀出核苷酸重復個數，但通過正常對照樣本和腫瘤組織樣本的測序圖譜對比應能夠準確判定是否存在序列長度變化。

申請人應詳述Sanger測序方法的建立、驗證過程，特別是測序引物設計、測序靶序列選擇（包括與試驗體外診斷試劑擴增序列對比）、反應體系驗證、測序結果判讀以及該測序方法的最低檢測限等性能驗證數據，舉例說明測序圖譜的判讀方法，必要時標示出串聯重復序列的位置。應詳述判讀方法設定的依據。

評價指標：每個微衛(wèi)星位點檢測陽性、陰性符合率95%置信區(qū)間下限一般不低于90%。

3.3 MSI檢測輔助鑒別結直腸癌中可能的LS患者的臨床性能研究

采用試驗體外診斷試劑與結直腸癌中LS診斷的臨床參考標準，即LS相關基因（主要為MLH1、MSH2、MSH6、PMS2，少部分為EPCAM）胚系突變檢測結果進行比較研究，評價產品臨床性能。胚系突變檢測可能涉及到NGS和MLPA(Multiplex Ligation- dependent Probe Amplification，多重連接探針擴增技術)（針對大片段缺失和插入）等方法；胚系突變的結果應依據國際上公認的指南和數據庫等進行判定。臨床試驗資料中應針對胚系突變檢測方法的建立和性能評價數據等進行詳細描述，并明確結果判定的依據。

入組病例應包括LS相關基因胚系突變陽性（包括致病性突變和可能致病性突變）和陰性病例。為了避免受試人群的選擇偏倚，建議針對符合入組標準的結直腸癌患者進行順序入組，如其中LS相關基因胚系突變陽性病例較少，可以采用適當的方式進行富集。應注意：富集入組的LS相關基因胚系突變陽性病例應不是依據MSI檢測進行篩選、并最終確診的患者，或者所依據的MSI檢測微衛(wèi)星位點組合應與試驗體外診斷試劑不同。

樣本量可采用如下公式進行估算：

公式中n為樣本量，Z1-α/2為置信度標準正態(tài)分布的分位數，P為評價指標預期值，Δ為P的允許誤差大小。

例如，根據已有文獻和數據，靈敏度預期值設為95%，特異度預期值設為85%，允許誤差Δ取值0.05。則陽性組最低樣本量為73例，陰性組最低樣本量195例。

為保證臨床性能評價的充分性，臨床試驗樣本量建議不低于上述估算樣本量，同時充分考慮可能的脫落率和臨床性能評價的需要，設定入組樣本量要求。

試驗結果采用四格表方式進行總結，計算試驗體外診斷試劑的臨床靈敏度和特異度及其95%置信區(qū)間。應針對總樣本、順序入組樣本和富集入組樣本試驗結果分別進行統(tǒng)計分析，其中順序入組樣本中，按照相關流行病學規(guī)律，應有一定數量LS相關基因胚系突變陽性樣本。

對于假陰性和假陽性結果，應充分結合臨床診斷的其他信息（例如基因胚系突變的具體情況、體細胞基因突變情況等）進行解釋和分析。

4.臨床試驗方案、小結和報告

各臨床試驗機構應采用同一方案，并在整個臨床試驗過程中嚴格執(zhí)行，不可隨意改動。方案中對試驗設計類型、對比方法選擇、受試者選擇、評價指標、統(tǒng)計分析方法、樣本量估算和質量控制要求等做出明確的規(guī)定，并根據各臨床試驗機構情況合理確定樣本量分配計劃。各臨床試驗機構選用的對比方法應保持一致，以便進行合理的統(tǒng)計學分析。

各臨床試驗機構應對臨床試驗數據和實施情況進行總結，出具臨床試驗小結。

臨床試驗報告應對整體臨床試驗實施過程、結果分析、試驗結論等進行條理分明的描述，并應包括必要的數據和統(tǒng)計分析方法。

（二）產品說明書

根據前文所述本指導原則適用產品的預期用途限定，產品說明書中【預期用途】項下建議描述為：本產品用于體外定性檢測結直腸癌患者腫瘤組織FFPE樣本基因組DNA中的微衛(wèi)星位點……（列出待測微衛(wèi)星位點名稱），通過與正常對照樣本檢測結果對比，確定是否發(fā)生了微衛(wèi)星序列長度變化。根據發(fā)生序列長度變化的微衛(wèi)星位點數量，將結直腸癌分為微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（MSI-H）、微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定（MSI-L）以及微衛(wèi)星穩(wěn)定（MSS）三種微衛(wèi)星狀態(tài)。檢測結果用于輔助鑒別結直腸癌中可能的林奇綜合征患者。

同時應注明：此類產品的應用應參考臨床相關診療指南的要求，檢測結果的解讀應結合其他臨床診斷信息、疾病家族史及實驗室檢測信息進行綜合分析。

如未進行用藥指導相關的臨床試驗，還應在說明書中注明：該產品尚未進行有關用藥指導的臨床性能評價。

三、參考文獻

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附件

關于微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）檢測試劑
的背景介紹

一、微衛(wèi)星與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性

微衛(wèi)星（microsatellite，MS）是指細胞基因組中以少數幾個核苷酸（一般為1～6個，多為單堿基或雙堿基）為單位串聯重復的DNA序列，又稱短串聯重復（short tandem repeat，STR）。微衛(wèi)星位點廣泛存在于人類基因組中，約占基因組3%。

在正常狀態(tài)下，微衛(wèi)星的長度保持不變，并且穩(wěn)定遺傳；DNA錯配修復（mismatch repair，MMR）功能出現異常時，微衛(wèi)星出現的復制錯誤得不到糾正并不斷累積，使得微衛(wèi)星序列長度發(fā)生改變，稱為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）。MSI根據程度可以被分成3類：微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（MSI-high，MSI-H）、微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定（MSI-low，MSI-L）、微衛(wèi)星穩(wěn)定（microsatellite stability，MSS）。

MSI現象于1993年在結直腸癌中首次發(fā)現。隨著研究深入，發(fā)現MSI現象不止存在于結直腸癌，在子宮內膜癌、胃癌、卵巢癌等實體瘤中均有發(fā)生。

二、MSI檢測在結直腸癌中的臨床意義

MSI是錯配修復功能缺陷導致的結果。在臨床實踐中，錯配修復功能狀態(tài)可以通過MMR蛋白免疫組織化學法（immunohistochemistry, IHC）檢測和MSI DNA檢測來反映。IHC檢測中錯配修復蛋白均有表達即為錯配修復功能完整（proficient mismatch repair，pMMR），任一錯配修復蛋白缺失即為錯配修復功能缺陷(deficient mismatch repair，dMMR)；MSI DNA檢測中，MSI-H通常提示為dMMR，MSI-L或MSS通常提示為pMMR。大量數據顯示，MMR蛋白IHC檢測和MSI DNA檢測結果一致性可以達到90%以上。

根據國內、外結直腸癌診療指南推薦，在結直腸癌病理學診斷過程中，應進行MMR蛋白IHC或MSI DNA檢測，從而確認患者的錯配修復狀態(tài)。其臨床意義有以下幾方面。

（一）MSI檢測用于結直腸癌預后評價和用藥指導

根據美國國立綜合癌癥網絡（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）結腸癌、直腸癌臨床實踐指南及中國臨床腫瘤學會（Chinese Society of Clinical Oncology，CSCO）結直腸癌診療指南，MSI可能是結直腸癌的預后因子，并與結直腸癌患者化療或免疫治療效果有關。有研究表明，dMMR/MSI-H的II期結直腸癌患者預后良好，且不會從單藥氟尿嘧啶類藥物的輔助化療中獲益。dMMR/MSI-H的晚期/轉移性結直腸癌患者可能從免疫治療（PD-1單抗）中獲益。

（二）MSI檢測用于輔助鑒別結直腸癌中可能的林奇綜合征患者

林奇綜合征（Lynch syndrome，LS）是一種常染色體顯性遺傳性腫瘤綜合征，2010年之前又被稱為遺傳性非息肉病性結直腸癌( hereditary non-polyposis colorectal cancer，HNPCC)。LS是最常見的遺傳性結直腸癌綜合征，約占結直腸癌發(fā)生率的3%。LS患者結直腸及其他多部位罹患惡性腫瘤的風險顯著升高，且平均發(fā)病年齡較輕。LS相關的致病基因主要包括MMR家族中的MLH1、MSH2、MSH6或PMS2基因，此外EPCAM基因胚系突變引起MSH2不表達也是導致LS的機理之一。由于MMR基因的功能失活性改變，LS患者往往表現為dMMR和(或)MSI-H表型。

以往依據阿姆斯特丹標準( Amsterdam criteria)和Bethesda 指南(Bethesda criteria guidelines)，結直腸癌中LS患者的識別和診斷主要依靠先證者的發(fā)病年齡、相關腫瘤家族史、組織病理學特征等，這種篩查策略的靈敏度較低。目前MMR蛋白IHC檢測和（或）MSI DNA檢測成為主流的LS篩查策略，CSCO結直腸癌診療指南推薦對于70歲以下（含70歲）結直腸癌患者均可進行MMR蛋白IHC檢測和（或）MSI DNA檢測以篩查可能的LS患者（二級推薦），dMMR/MSI-H 患者進行LS相關基因的胚系突變檢測，以明確診斷。NCCN結腸癌、直腸癌臨床實踐指南等基于成本效益分析，認為可以對所有結直腸癌患者進行MMR蛋白IHC檢測或MSI DNA檢測，以篩查LS患者。

（三）指導原則適用范圍的考慮

綜合以上背景信息，MSI檢測對于結直腸癌患者預后評價、用藥指導和LS的輔助篩選有重要的臨床意義?；谀壳芭R床實踐和體外診斷試劑審評經驗，本指導原則適用的產品主要指預期用途限定為結直腸癌患者LS輔助篩選的診斷試劑，檢測方法學主要針對熒光PCR-毛細管電泳法。

三、MMR蛋白IHC檢測和MSI DNA檢測的優(yōu)勢和局限

MMR蛋白IHC檢測和MSI DNA檢測在評價錯配修復功能狀態(tài)中各有優(yōu)勢和局限。

IHC檢測的優(yōu)勢是操作簡便，檢測平臺普及性高，并可以直接反映可能導致MSI-H發(fā)生的MMR缺陷基因，存在的問題是IHC影響因素較為復雜，常因樣本前處理不規(guī)范和結果判讀標準掌握不當導致結果不準確。此外，罕見的情況下，MMR基因的錯義突變可能導致MMR蛋白的氨基酸序列發(fā)生改變，蛋白功能障礙，但抗原性完整，表現為MMR功能缺陷但IHC染色仍呈現正常表達的“假陰性”結果。

MSI的DNA檢測更易標準化，可以實現較好的重復性。但只能選擇若干確定的微衛(wèi)星位點進行檢測，有可能由于位點代表性問題造成“假陰性”，且檢測條件要求較高、常需要配對受試者的正常對照樣本。組織樣本中腫瘤細胞比例低、腫瘤組織異質性等問題可能會影響檢測質量，造成“假陰性”結果。此外，有研究表明，某些MSH6胚系突變發(fā)生時PCR檢測可能表現為MSS，從而造成MSI檢測針對LS的假陰性結果。

NCCN結直腸癌遺傳高風險評估指南中指出，對于LS患者，IHC和MSI檢測分別有5～10%的假陰性。